Raybio玻璃蛋白质芯片简介
I. 引言
RayBio®蛋白芯片是RayBiotech公司开发的一系列产品，RayBiotech公司是蛋白芯片这一领域的拓荒者。重组和内源蛋白被点在一种固体支持物上，如膜或玻片。这些试剂盒可用于筛选蛋白间的相互作用，监测抗体的自表达，确定抗体的特异性，检测蛋白修饰及小分子与蛋白间的相互作用。
RayBiotech公司也同样接受定制蛋白芯片的业务。您可以选择您所感兴趣的蛋白或者您也可以提供您自己手头的蛋白。RayBiotech公司然後就可以为您生产定制蛋白芯片了。
RayBiotech公司也同样接受定制蛋白芯片的业务。您可以选择您所感兴趣的蛋白或者您也可以提供您自己手头的蛋白。RayBiotech公司然後就可以为您生产定制蛋白芯片了。
应用
由于RayBio®蛋白芯片有多种用途，各用途有不同的操作流程，一下仅给出几个实例。
1、蛋白间相互作用的检测。这种试剂盒可用于研究新的蛋白间相互作用，验证已知的蛋白间相互作用并可用于确定蛋白相互作用的条件。
2、表征抗体。这种试剂盒可用于检测抗体的特异性。
3、目标识别。这种试剂盒可用于筛选小分子蛋白间的相互作用以用于目标识别，药物开发及毒性检测。
4、 检测自表达抗体。这种试剂盒可用于表征体液中的自表达抗体。
5、检测蛋白修饰。这种试剂盒可用于检测蛋白修饰如磷酸化。
6、检测蛋白DNA间相互作用。在某些情况下，这种试剂盒可用于检测DNA键合蛋白质。
1、蛋白间相互作用的检测。这种试剂盒可用于研究新的蛋白间相互作用，验证已知的蛋白间相互作用并可用于确定蛋白相互作用的条件。
2、表征抗体。这种试剂盒可用于检测抗体的特异性。
3、目标识别。这种试剂盒可用于筛选小分子蛋白间的相互作用以用于目标识别，药物开发及毒性检测。
4、 检测自表达抗体。这种试剂盒可用于表征体液中的自表达抗体。
5、检测蛋白修饰。这种试剂盒可用于检测蛋白修饰如磷酸化。
6、检测蛋白DNA间相互作用。在某些情况下，这种试剂盒可用于检测DNA键合蛋白质。
RayBio®蛋白芯片的特点
高通量以实现检测多种蛋白的功能，包括蛋白间相互作用，蛋白修饰，抗体特异性，表达自抗体及小分子与蛋白间相互作用。
玻片与膜型式
价格实惠，操作迅速且使用简单
使用膜芯片时无需其它辅助设备
玻片与膜型式
价格实惠，操作迅速且使用简单
使用膜芯片时无需其它辅助设备
II. 提供的原材料
拿到产品後，RayBio®人蛋白芯片应储藏在-20℃至-80℃条件下直至试验前取出使用。在-20℃至-80℃条件下该试剂盒可最长保存6个月活性不变。请在购买後6个月内用完。一经解冻，玻璃芯片及阻断缓冲液都应保藏在-20℃条件下，其他组分都应保藏在4℃条件下。试剂解冻後请在3个月内用完。
对于玻璃蛋白芯片
RayBio®人蛋白芯片（2，4或8芯片）
生物素化抗抗体（1000×）（1.5 µl/管生物素化小鼠的抗IgG, 1.5 µl/管生物素化兔的抗IgG，1.5 µl/管生物素化人的抗IgG）
阻断缓冲液（2×，4ml）
洗涤液I (20×，15 ml)
洗涤液II (20×，15 ml)
连接缓冲液（2×，RIPA缓冲液，20 mM Tris, pH 7.5, 0.3 M NaCl, 2%脱氧胆酸钠，2% TX-100）10ml
链霉素化荧光染料（1000×，1.5µl）
对于玻璃蛋白芯片
RayBio®人蛋白芯片（2，4或8芯片）
生物素化抗抗体（1000×）（1.5 µl/管生物素化小鼠的抗IgG, 1.5 µl/管生物素化兔的抗IgG，1.5 µl/管生物素化人的抗IgG）
阻断缓冲液（2×，4ml）
洗涤液I (20×，15 ml)
洗涤液II (20×，15 ml)
连接缓冲液（2×，RIPA缓冲液，20 mM Tris, pH 7.5, 0.3 M NaCl, 2%脱氧胆酸钠，2% TX-100）10ml
链霉素化荧光染料（1000×，1.5µl）
辅助材料
根据不同的需求，需要采用不同的辅助材料，如：
摇床
激光扫描仪及荧光检测器
铝箔
蒸馏水
塑料盒
你自己所需的连接缓冲液
摇床
激光扫描仪及荧光检测器
铝箔
蒸馏水
塑料盒
你自己所需的连接缓冲液
III. 流程概览及注意事项
A. 样品的制备
针对你的实验目的，你也许需要不同的样品。检测蛋白间相互作用，你也许需要对蛋白标上生物素或针对添加蛋白使用对应的抗体。为检测自抗体，你还得准备血清或血浆。为表征抗体的特异性，你需要你所感兴趣的抗体。
实验条件的优化：如果你的实验的本底颜色太深，你也许需要进一步稀释你的样品，有必要你可能还需要将玻璃芯片在4℃条件下在洗涤液I中浸泡过夜。如果信号强度太弱，你也许得增加样品量，或者延长某一步或几步的温育的时间。
针对你的实验目的，你也许需要不同的样品。检测蛋白间相互作用，你也许需要对蛋白标上生物素或针对添加蛋白使用对应的抗体。为检测自抗体，你还得准备血清或血浆。为表征抗体的特异性，你需要你所感兴趣的抗体。
实验条件的优化：如果你的实验的本底颜色太深，你也许需要进一步稀释你的样品，有必要你可能还需要将玻璃芯片在4℃条件下在洗涤液I中浸泡过夜。如果信号强度太弱，你也许得增加样品量，或者延长某一步或几步的温育的时间。
B. 玻璃芯片的处理
芯片很敏感。切勿触碰芯片的表面。拿的时候只允许用手接触芯片的边缘 。
接触洗涤液及芯片时要用非乳胶手套。
切忌打碎芯片。
在洁净的环境下处理芯片。
芯片很敏感。切勿触碰芯片的表面。拿的时候只允许用手接触芯片的边缘 。
接触洗涤液及芯片时要用非乳胶手套。
切忌打碎芯片。
在洁净的环境下处理芯片。
C. 温育
温育时用样品或缓冲液完全复盖芯片，并且用胶布或是塑料薄膜盖住温育盒避免挥发。
温育时避免产生气泡。
温育和洗涤时应轻轻摇晃或震荡芯片。
温育时在温育盒上复盖一层胶布，当温育时间超过2h或样品及试剂量不足400 µl时，这样做尤其重要。
避免加液过量导致试剂流到临近的孔中造成交叉污染。
像阻断温育，样品温育，生物素化-Ab温育及链霉素化荧光染料的温育等也可在4℃下过夜。请务必要保证将温育盒盖紧以防挥发。
温育时用样品或缓冲液完全复盖芯片，并且用胶布或是塑料薄膜盖住温育盒避免挥发。
温育时避免产生气泡。
温育和洗涤时应轻轻摇晃或震荡芯片。
温育时在温育盒上复盖一层胶布，当温育时间超过2h或样品及试剂量不足400 µl时，这样做尤其重要。
避免加液过量导致试剂流到临近的孔中造成交叉污染。
像阻断温育，样品温育，生物素化-Ab温育及链霉素化荧光染料的温育等也可在4℃下过夜。请务必要保证将温育盒盖紧以防挥发。
D. 组装温育盒
IV. 原理
A. 蛋白间相互作用的检测
蛋白间相互作用的检测有好几种方法，
RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
下面的原理适用于使用探针蛋白的抗体
a. （阻断）Blocking 及温育
注：如果你已将芯片集中到一起，你可以直接进入步骤3.
1、 从盒中取出玻璃芯片。在层流罩中干燥至少60min
2、 如步骤III D将芯片聚集到一块温育盒上。
3、 用H2O稀释阻断缓冲液（2×）。加500µl 1x阻断稀释液至每孔中并在室温下温育30min以阻断芯片。确保孔中无气泡。
注：只向加有蛋白的孔中加试剂。
4、 倒出孔中的阻断缓冲液。向每孔中加入400 µl相应的样品。室温下温育1-2h或在其他条件下温育适当时间。
注：我们建议在您的试验中使用1-100 µg蛋白。看情况调整蛋白用量，若本底颜色太深，则减少蛋白用量。若信号太弱，则要增加蛋白用量。不同的蛋白相互作用也许需要不同的binding缓冲液。
5、 用H2O稀释洗涤液I（20×）.倒出每孔中的样品，在室温下洗涤5遍，每次用800 µl洗涤液I（1×），并轻轻震荡2min。每次洗涤过後，倒尽洗涤液I。
注：避免加液过量导致液体流入邻近孔中。
6、 用H2O稀释洗涤液II（20×）。室温下洗涤2遍，每次用800 µl洗涤液II（1×），并震荡2min。每次洗涤过後，倒尽洗涤液II。
b.相关蛋白的检测
针对不同的试验设计，可使用不同的原理。
如果生物素标记的蛋白用作探针，接着这一步骤进行以下操作。
1、 用H2O稀释链霉素化荧光染料（1000×）。向每块子芯片中400µl链霉素化荧光染料（1×）（在经过简单的spinning後，向链霉素化荧光染料的试管中加入1.5ml1×阻断缓冲液）。在温育盒上盖一层胶布。在其上盖一层铝箔或置于暗箱中以避免光照。
2、 室温温育1-2h。
注：温育也可在4℃下过夜进行。
3、 如上a.5步骤所示用洗涤液I洗涤并按a.6步骤所示用洗涤液II洗涤。
注：如果使用了未标记的蛋白，则必须保证可以使用蛋白抗体或是融合标记。
1、 向每孔中加入400µl稀释适当倍数的抗体。室温温育2h。
注：温育也可在4℃下过夜进行。通常要使用1-1000 ng/ml的样品。在此试验中，针对你的特殊抗体，你也要确定一个合适的稀释倍数。
2、 如步骤5所示用洗涤液I洗涤并如步骤6所示用洗涤液II洗涤。
3、 加入400 µl稀释了1000倍的生物素标记抗IgG（小鼠抗体的话则使用小鼠的抗IgG，兔的抗体的话则使用兔的抗IgG，依此类推）。室温温育1h。
4、 如步骤5所示用洗涤液I洗涤并如步骤6所示用洗涤液II洗涤。
5、 向每块子芯片中400µl链霉素化荧光染料（1×）（在经过简单的spinning後，向链霉素化荧光染料的试管中加入1.5ml 1×阻断缓冲液）。在温育盒上盖一层胶布。在其上盖一层铝箔或置于暗箱中以避免光照。
6、 室温温育1-2h。
7、用洗涤液I洗涤，用洗涤液II洗涤。
c.荧光检测
1、 倒尽孔中剩馀的洗涤液。
2、 从温育盒上拆下芯片。
3、 将整块芯片放入一50ml的离心管。加入足量的洗涤液I（约30ml）使芯片浸没，室温下轻轻震荡或摇晃10min。倒尽洗涤液I。用洗涤液I再洗一遍。再用洗涤液II（约30ml）洗涤，室温下轻轻震荡或摇晃10min。或使用玻璃芯片盒洗涤。用蒸馏水冲洗芯片。
4、 1000rpm下离心3min，去除所有的水滴，然後在空气中干燥至少20min。在进行扫描前请确保芯片完全干燥。
5、 利用激光扫描仪(如 Axon GenePix)的cy3（绿光）频道来产生图像信号。
注：尽管我们建议在实验结束後应立即对芯片进行扫描，您还可以在暗处将芯片置于-20℃下贮存几天的时间。如果您没有配备激光扫描仪的话，您可以将芯片寄给我们，我们可以代为您扫描。
B. 表征抗体特异性
表征抗体特异性的方法有好几种， RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
以下原理适用于标记的二级抗体的使用
a. 阻断及温育
注：如果你已将芯片集中到一起，你可以直接进入步骤3.
1、 从盒中取出玻璃芯片。在层流罩中干燥至少60min
2、 如步骤III D将芯片聚集到一块温育盒上。
3、 加500µl 1x阻断稀释液至每孔中并在室温下温育30min以阻断芯片。用H2O稀释阻断缓冲液（2×）。确保孔中无气泡。
4、 倒出孔中的阻断缓冲液。加入400 µl相应的样品如抗血清或IgG。室温下温育1h。
5、 倒出每孔中的样品，在室温下洗涤5遍，每次用800 µl洗涤液I（1×），并轻轻震荡2min。用H2O稀释洗涤液I（20×）.每次洗涤过後，倒尽洗涤液I。
注：避免加液过量导致液体流入邻近孔中。
6、 室温下洗涤2遍，每次用800 µl洗涤液II（1×），并震荡2min。用H2O稀释洗涤液II（20×）以制备1×洗涤液II。每次洗涤过後，倒尽洗涤液II。
7、 加入400 µl稀释了1000倍的生物素标记的二级抗体（选择适合的二级抗体，对小鼠抗体选用生物素标记的小鼠的抗IgG；对于兔的抗体，选用生物素标记的兔的抗IgG）。为了制备1×生物素标记的二级抗体，向生物素标记的二级抗体管中加入1.5ml的阻断缓冲液。
8、 按步骤6所示用洗涤液I洗涤，如步骤7所示用洗涤液II 洗涤。
b. 荧光检测
1、 倒尽孔中剩馀的洗涤液。
2、 从温育盒上拆下芯片。
3、将整块芯片放入一50ml的离心管。加入足量的洗涤液I（约30ml）使芯片浸没，室温下轻轻震荡或摇晃10min。倒尽洗涤液I。用洗涤液I再洗一遍。再用洗涤液II（约30ml）洗涤，室温下轻轻震荡或摇晃10min。或使用玻璃芯片盒洗涤。用蒸馏水冲洗芯片。
4、 1000rpm下离心3min，去除所有的水滴，然後在空气中干燥至少20min。在进行扫描前请确保芯片完全干燥。
5、 利用激光扫描仪(如 Axon GenePix)的cy3（绿光）频道来产生图像信号
注：尽管我们建议在实验结束後应立即对芯片进行扫描，您还可以在暗处将芯片置于-20℃下贮存几天的时间。如果您没有配备激光扫描仪的话，您可以将芯片寄给我们，我们可以代为您扫描。
C. 自体抗体的检测
接下来的方法可以用于检测自体抗体，
RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
a. 阻断及温育
注：如果你已将芯片集中到一起，你可以直接进入步骤3.
1、 从盒中取出玻璃芯片。在空气中干燥至少60min
2、 如步骤III D将芯片聚集到一块温育盒上。
3、 加500µl 1x阻断稀释液至每孔中并在室温下温育30min以阻断芯片。用H2O稀释阻断缓冲液（2×）。确保孔中无气泡。
4、 加入400 µl的血清或血浆或其他体液。室温温育1h。将血清或血浆稀释10到20倍。注：由于血清或血浆中的自抗体浓度变化范围很广，因此对你的样品你得有一个合适的稀释倍数。我们平常实验时习惯稀释100倍。
5、 倒出每孔中的样品，在室温下洗涤5遍，每次用800 µl洗涤液I（1×），并轻轻震荡2min。用H2O稀释洗涤液I（20×）。每次洗涤过後，倒尽洗涤液I。
注：避免加液过量导致液体流入邻近孔中。
6、 室温下洗涤2遍，每次用800 µl洗涤液II（1×），并震荡2min。用H2O稀释洗涤液II（20×）以制备1×洗涤液II。每次洗涤过後，倒尽洗涤液II。
7、 加入400µl稀释了1000倍的人的抗IgG（在经过简单的spinning後，向生物素化人的抗IgG的试管中加入1.5ml 1×阻断缓冲液）。室温温育1-2h。
8、 如步骤5和6稀释。
9、 向每块子芯片中400µl链霉素化荧光染料（1×）（在经过简单的spinning後，向链霉素化荧光染料的试管中加入1.5ml 1×阻断缓冲液）。在温育盒上盖一层胶布。在其上盖一层铝箔或置于暗箱中以避免光照。
10、室温温育1-2h。
注：温育也可在4℃下过夜。
11、按步骤7所示用洗涤液I洗涤，如步骤8所示用洗涤液II 洗涤
b.荧光检测
1、 倒尽孔中剩馀的洗涤液。
2、 从温育盒上拆下芯片。
3、 将整块芯片放入一50ml的离心管。加入足量的洗涤液I（约30ml）使芯片浸没，室温下轻轻震荡或摇晃10min。倒尽洗涤液I。用洗涤液I再洗一遍。再用洗涤液II（约30ml）洗涤，室温下轻轻震荡或摇晃10min。或使用玻璃芯片盒洗涤。用蒸馏水冲洗芯片。
4、 1000rpm下离心3min，去除所有的水滴，然後在空气中干燥至少20min。在进行扫描前请确保芯片完全干燥。
5、 利用激光扫描仪(如 Axon GenePix)的cy3（绿光）频道来产生图像信号
注：尽管我们建议在实验结束後应立即对芯片进行扫描，您还可以在暗处将芯片置于-20℃下贮存几天的时间。如果您没有配备激光扫描仪的话，您可以将芯片寄给我们，我们可以代为您扫描。
D. 小分子与蛋白质之间的相互作用的检测
小分子与蛋白质之间的相互作用的检测有好几种方法
RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
E.蛋白修饰的检测
RayBio®生产的人的蛋白芯片也可以用于检测蛋白修饰情况。检测磷酸化修饰的几种方法
RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
V. 结果分析：
激光扫描仪获得的信号强度可以简单的输入我们的分析工具。这个分析工具可以帮您做到：
将信号定位于蛋白芯片谱上
蛋白列表排序
平均信号强度
减去本底信号
对来自不同样本的数据进行拟合
获得不同样本的比较图表
这个分析工具不仅使用方便而且价格实惠，这不仅有助于您的数据的组织和处理，而且将您的计算简化为“复制和剪切”。
1、 在体外和体内蛋白质的功能可能不同。
2、 有些重组蛋白还包含一个尾序列。有些重组蛋白又缺了一些片段，特别是疏水区。这些蛋白的修饰情况大都未知。所有的这些都有可能影响到蛋白之间的相互作用。
3、 几乎所有的膜蛋白都只有胞外片段，但缺少跨膜及胞内片段。
4、 不同的蛋白发挥作用的最有条件也许不同。因此，在某些条件下研究人员在做芯片实验时要使用不同的条件。
5、由于IgG和链霉素都有可能连接到某些蛋白上，因此必须要有质控。
蛋白间相互作用的检测有好几种方法，
RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
下面的原理适用于使用探针蛋白的抗体
a. （阻断）Blocking 及温育
注：如果你已将芯片集中到一起，你可以直接进入步骤3.
1、 从盒中取出玻璃芯片。在层流罩中干燥至少60min
2、 如步骤III D将芯片聚集到一块温育盒上。
3、 用H2O稀释阻断缓冲液（2×）。加500µl 1x阻断稀释液至每孔中并在室温下温育30min以阻断芯片。确保孔中无气泡。
注：只向加有蛋白的孔中加试剂。
4、 倒出孔中的阻断缓冲液。向每孔中加入400 µl相应的样品。室温下温育1-2h或在其他条件下温育适当时间。
注：我们建议在您的试验中使用1-100 µg蛋白。看情况调整蛋白用量，若本底颜色太深，则减少蛋白用量。若信号太弱，则要增加蛋白用量。不同的蛋白相互作用也许需要不同的binding缓冲液。
5、 用H2O稀释洗涤液I（20×）.倒出每孔中的样品，在室温下洗涤5遍，每次用800 µl洗涤液I（1×），并轻轻震荡2min。每次洗涤过後，倒尽洗涤液I。
注：避免加液过量导致液体流入邻近孔中。
6、 用H2O稀释洗涤液II（20×）。室温下洗涤2遍，每次用800 µl洗涤液II（1×），并震荡2min。每次洗涤过後，倒尽洗涤液II。
b.相关蛋白的检测
针对不同的试验设计，可使用不同的原理。
如果生物素标记的蛋白用作探针，接着这一步骤进行以下操作。
1、 用H2O稀释链霉素化荧光染料（1000×）。向每块子芯片中400µl链霉素化荧光染料（1×）（在经过简单的spinning後，向链霉素化荧光染料的试管中加入1.5ml1×阻断缓冲液）。在温育盒上盖一层胶布。在其上盖一层铝箔或置于暗箱中以避免光照。
2、 室温温育1-2h。
注：温育也可在4℃下过夜进行。
3、 如上a.5步骤所示用洗涤液I洗涤并按a.6步骤所示用洗涤液II洗涤。
注：如果使用了未标记的蛋白，则必须保证可以使用蛋白抗体或是融合标记。
1、 向每孔中加入400µl稀释适当倍数的抗体。室温温育2h。
注：温育也可在4℃下过夜进行。通常要使用1-1000 ng/ml的样品。在此试验中，针对你的特殊抗体，你也要确定一个合适的稀释倍数。
2、 如步骤5所示用洗涤液I洗涤并如步骤6所示用洗涤液II洗涤。
3、 加入400 µl稀释了1000倍的生物素标记抗IgG（小鼠抗体的话则使用小鼠的抗IgG，兔的抗体的话则使用兔的抗IgG，依此类推）。室温温育1h。
4、 如步骤5所示用洗涤液I洗涤并如步骤6所示用洗涤液II洗涤。
5、 向每块子芯片中400µl链霉素化荧光染料（1×）（在经过简单的spinning後，向链霉素化荧光染料的试管中加入1.5ml 1×阻断缓冲液）。在温育盒上盖一层胶布。在其上盖一层铝箔或置于暗箱中以避免光照。
6、 室温温育1-2h。
7、用洗涤液I洗涤，用洗涤液II洗涤。
c.荧光检测
1、 倒尽孔中剩馀的洗涤液。
2、 从温育盒上拆下芯片。
3、 将整块芯片放入一50ml的离心管。加入足量的洗涤液I（约30ml）使芯片浸没，室温下轻轻震荡或摇晃10min。倒尽洗涤液I。用洗涤液I再洗一遍。再用洗涤液II（约30ml）洗涤，室温下轻轻震荡或摇晃10min。或使用玻璃芯片盒洗涤。用蒸馏水冲洗芯片。
4、 1000rpm下离心3min，去除所有的水滴，然後在空气中干燥至少20min。在进行扫描前请确保芯片完全干燥。
5、 利用激光扫描仪(如 Axon GenePix)的cy3（绿光）频道来产生图像信号。
注：尽管我们建议在实验结束後应立即对芯片进行扫描，您还可以在暗处将芯片置于-20℃下贮存几天的时间。如果您没有配备激光扫描仪的话，您可以将芯片寄给我们，我们可以代为您扫描。
B. 表征抗体特异性
表征抗体特异性的方法有好几种， RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
以下原理适用于标记的二级抗体的使用
a. 阻断及温育
注：如果你已将芯片集中到一起，你可以直接进入步骤3.
1、 从盒中取出玻璃芯片。在层流罩中干燥至少60min
2、 如步骤III D将芯片聚集到一块温育盒上。
3、 加500µl 1x阻断稀释液至每孔中并在室温下温育30min以阻断芯片。用H2O稀释阻断缓冲液（2×）。确保孔中无气泡。
4、 倒出孔中的阻断缓冲液。加入400 µl相应的样品如抗血清或IgG。室温下温育1h。
5、 倒出每孔中的样品，在室温下洗涤5遍，每次用800 µl洗涤液I（1×），并轻轻震荡2min。用H2O稀释洗涤液I（20×）.每次洗涤过後，倒尽洗涤液I。
注：避免加液过量导致液体流入邻近孔中。
6、 室温下洗涤2遍，每次用800 µl洗涤液II（1×），并震荡2min。用H2O稀释洗涤液II（20×）以制备1×洗涤液II。每次洗涤过後，倒尽洗涤液II。
7、 加入400 µl稀释了1000倍的生物素标记的二级抗体（选择适合的二级抗体，对小鼠抗体选用生物素标记的小鼠的抗IgG；对于兔的抗体，选用生物素标记的兔的抗IgG）。为了制备1×生物素标记的二级抗体，向生物素标记的二级抗体管中加入1.5ml的阻断缓冲液。
8、 按步骤6所示用洗涤液I洗涤，如步骤7所示用洗涤液II 洗涤。
b. 荧光检测
1、 倒尽孔中剩馀的洗涤液。
2、 从温育盒上拆下芯片。
3、将整块芯片放入一50ml的离心管。加入足量的洗涤液I（约30ml）使芯片浸没，室温下轻轻震荡或摇晃10min。倒尽洗涤液I。用洗涤液I再洗一遍。再用洗涤液II（约30ml）洗涤，室温下轻轻震荡或摇晃10min。或使用玻璃芯片盒洗涤。用蒸馏水冲洗芯片。
4、 1000rpm下离心3min，去除所有的水滴，然後在空气中干燥至少20min。在进行扫描前请确保芯片完全干燥。
5、 利用激光扫描仪(如 Axon GenePix)的cy3（绿光）频道来产生图像信号
注：尽管我们建议在实验结束後应立即对芯片进行扫描，您还可以在暗处将芯片置于-20℃下贮存几天的时间。如果您没有配备激光扫描仪的话，您可以将芯片寄给我们，我们可以代为您扫描。
C. 自体抗体的检测
接下来的方法可以用于检测自体抗体，
RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
a. 阻断及温育
注：如果你已将芯片集中到一起，你可以直接进入步骤3.
1、 从盒中取出玻璃芯片。在空气中干燥至少60min
2、 如步骤III D将芯片聚集到一块温育盒上。
3、 加500µl 1x阻断稀释液至每孔中并在室温下温育30min以阻断芯片。用H2O稀释阻断缓冲液（2×）。确保孔中无气泡。
4、 加入400 µl的血清或血浆或其他体液。室温温育1h。将血清或血浆稀释10到20倍。注：由于血清或血浆中的自抗体浓度变化范围很广，因此对你的样品你得有一个合适的稀释倍数。我们平常实验时习惯稀释100倍。
5、 倒出每孔中的样品，在室温下洗涤5遍，每次用800 µl洗涤液I（1×），并轻轻震荡2min。用H2O稀释洗涤液I（20×）。每次洗涤过後，倒尽洗涤液I。
注：避免加液过量导致液体流入邻近孔中。
6、 室温下洗涤2遍，每次用800 µl洗涤液II（1×），并震荡2min。用H2O稀释洗涤液II（20×）以制备1×洗涤液II。每次洗涤过後，倒尽洗涤液II。
7、 加入400µl稀释了1000倍的人的抗IgG（在经过简单的spinning後，向生物素化人的抗IgG的试管中加入1.5ml 1×阻断缓冲液）。室温温育1-2h。
8、 如步骤5和6稀释。
9、 向每块子芯片中400µl链霉素化荧光染料（1×）（在经过简单的spinning後，向链霉素化荧光染料的试管中加入1.5ml 1×阻断缓冲液）。在温育盒上盖一层胶布。在其上盖一层铝箔或置于暗箱中以避免光照。
10、室温温育1-2h。
注：温育也可在4℃下过夜。
11、按步骤7所示用洗涤液I洗涤，如步骤8所示用洗涤液II 洗涤
b.荧光检测
1、 倒尽孔中剩馀的洗涤液。
2、 从温育盒上拆下芯片。
3、 将整块芯片放入一50ml的离心管。加入足量的洗涤液I（约30ml）使芯片浸没，室温下轻轻震荡或摇晃10min。倒尽洗涤液I。用洗涤液I再洗一遍。再用洗涤液II（约30ml）洗涤，室温下轻轻震荡或摇晃10min。或使用玻璃芯片盒洗涤。用蒸馏水冲洗芯片。
4、 1000rpm下离心3min，去除所有的水滴，然後在空气中干燥至少20min。在进行扫描前请确保芯片完全干燥。
5、 利用激光扫描仪(如 Axon GenePix)的cy3（绿光）频道来产生图像信号
注：尽管我们建议在实验结束後应立即对芯片进行扫描，您还可以在暗处将芯片置于-20℃下贮存几天的时间。如果您没有配备激光扫描仪的话，您可以将芯片寄给我们，我们可以代为您扫描。
D. 小分子与蛋白质之间的相互作用的检测
小分子与蛋白质之间的相互作用的检测有好几种方法
RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
E.蛋白修饰的检测
RayBio®生产的人的蛋白芯片也可以用于检测蛋白修饰情况。检测磷酸化修饰的几种方法
RayBiotech可以在实验设计上给予您一些帮助并且还可以为您的项目提供检测服务。如需帮助，请随时联系我们。
V. 结果分析：
激光扫描仪获得的信号强度可以简单的输入我们的分析工具。这个分析工具可以帮您做到：
将信号定位于蛋白芯片谱上
蛋白列表排序
平均信号强度
减去本底信号
对来自不同样本的数据进行拟合
获得不同样本的比较图表
这个分析工具不仅使用方便而且价格实惠，这不仅有助于您的数据的组织和处理，而且将您的计算简化为“复制和剪切”。
1、 在体外和体内蛋白质的功能可能不同。
2、 有些重组蛋白还包含一个尾序列。有些重组蛋白又缺了一些片段，特别是疏水区。这些蛋白的修饰情况大都未知。所有的这些都有可能影响到蛋白之间的相互作用。
3、 几乎所有的膜蛋白都只有胞外片段，但缺少跨膜及胞内片段。
4、 不同的蛋白发挥作用的最有条件也许不同。因此，在某些条件下研究人员在做芯片实验时要使用不同的条件。
5、由于IgG和链霉素都有可能连接到某些蛋白上，因此必须要有质控。