QIAGEN替您完成real-time PCR引物设计和反应优化
摘要： 随着荧光定量PCR仪的普及，荧光定量PCR也开始飞入寻常实验室了。不过real-time PCR可不像终端PCR那么轻巧。由于涉及若干种荧光标记，定量PCR头一件麻烦事就是引物和探针的设计。QIAGEN不仅是核酸纯化方面的老大哥，在定量PCR上也有一手。目前很多研究中心包括我国的CDC，都在采用Q家的定量PCR试剂。为何这么有市场，让生物通来为你揭晓其中的秘密。
随着荧光定量PCR仪的普及，荧光定量PCR也开始飞入寻常实验室了。不过real-time PCR可不像终端PCR那么轻巧。常规PCR只要扩出条带就算行，条带深点浅点偶尔有点副产物问题不太大，而实时定量PCR既然目标是定量，自然就要严谨得多。稍有偏差都会被级数放大而严重影响结果。由于涉及若干种荧光标记，定量PCR头一件麻烦事就是引物和探针的设计。虽说科研是re-search的过程，但估计没人愿意在同一个实验上反反复复花上几个月的时间，天天搞troubleshooting，那么，我们就应该选择一些可信赖的产品。
简单快速
SYBR Green的荧光定量PCR方法是很多人的青睐，一来价格比较实惠，二则不用设计探针。但是，SYBR Green法绝非常规PCR+SYBR Green这么简单。这种方法饱受诟病的地方就是少了探针，专一性没那么好。其实只要引物设计得好，同样能得到高特异性的结果。引物设计在SYBR Green的荧光定量PCR方法中尤显重要。QIAGEN就推出了专为SYBR Green荧光定量法而设计的QuantiTect引物对。它是经生物信息学验证的，特异性强，灵敏度高，不形成引物二聚体，是基因表达分析的不二选择，例如RNAi和芯片的结果验证。更重要的是，QuantiTect引物对和QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit配合使用，就完全不必担心实验没结果，可以天天高枕无忧了，因为QIAGEN 100%保证实验结果。你可能觉得奇怪，QuantiTect引物对又不是全部经过实验室验证，为什么QIAGEN如此自信。据QIAGEN的技术专家介绍，QuantiTect引物对在欧美很畅销，凡是用过的都是happy ending，从没有不成功的案例。此外，QIAGEN的专家有着几十万条引物设计的丰富经验，在设计时考虑更周全，且经过严格的生物信息学验证，比自己设计引物当然更有优势。因此，QIAGEN才敢拍着胸脯说100%保障。就算你万一不好彩碰上一对没结果的，QIAGEN也会负责到底，免费提供相关试剂直到实验成功。
成功的荧光定量PCR除了需要有好的引物，试剂也是关键。一步法的QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit就是QuantiTect引物对的好搭档。顾名思义，这个试剂盒最大的特点是快，比市面上普遍用的master mix可提速到达60%，最快约45分钟。你再也不用成天霸占着实验室的定量PCR仪了。速度大提升主要归功于缓冲液中的新组分Q-Bond。Q-Bond里的专利组分能提高单链Primer和Taq酶之间的亲和性，使得Taq酶-Primer复合物可以同时结合到模板上，这样退火和延伸就同时进行了。且优化的缓冲液还可帮助DNA解链并减少二级结构，使得变性和延伸步骤的时间更加缩短，因而QuantiFast每个循环的完整的退火延伸时间仅需要30秒（变性时间10秒）。另外，聚合酶也升级了。HotStarTaq Plus DNA聚合酶只需5分钟就能脱去修饰完全恢复Taq酶活性，比以前的HotStarTaq节省了10分钟。至于检测灵敏度，试剂盒里的Sensiscript和Omniscript反转录酶二合一应该不会让你失望，即使目标低至几个拷贝，也能准确检测。
美国杜兰国立灵长目研究中心（Tulane National Primate Research Center）的研究人员利用芯片比较了2D和3D培养模式下细胞的基因表达差异，并用QuantiTect 引物对和QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit来验证了影响G1/S细胞周期检测点的4个基因，发现其中3个基因的表达变化与芯片结果一致1。
灵敏可靠探针法
做荧光定量PCR，准确当然是第一要务。这也是很多人钟情于探针法的原因。QuantiTect Probe RT-PCR Kit就是上文提到的各CDC用于检测禽流感的试剂盒了。除了我国的CDC，还有很多研究人员也选择了它作为病毒检测工具。德国诊断病毒研究所（Institute of Diagnostic Virology）的科学家们就证明QIAGEN的QuantiTect Probe RT-PCR Kit是灵敏特异检测高致病性禽流感病毒H5N1（青海株）的有力工具2。他们认为，在此试剂盒及探针的协助下，能对HPAIV H5N1进行快速分型，比常规的RT-PCR和SYBR Green法更好。该方法让他们成功检测到2006年德国野生鸟类中H5N1禽流感的爆发，现已成为德国国际兽疫局（OIE）和国家禽流感参考实验室的常规检测手段。另外，奥地利健康与食品安全局的研究人员还利用QuantiTect Probe RT-PCR Kit检测样品中的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）3。
研究人员之所以对这个试剂盒情有独钟，主要看中的就是它的高灵敏度。试剂盒中HotStarTaq DNA聚合酶和独特的缓冲液配方确保了它能对低拷贝的RNA目标进行准确定量。HotStarTaq DNA聚合酶采用化学修饰，在室温时完全失活，这就避免了加样、反转录和第一次变性过程中错配产物或引物二聚体的延伸。只有在95℃孵育15分钟，才能完全脱去修饰恢复Taq酶的活性。这个过程也同时灭活了反转录酶，一石二鸟。
QuantiTect Probe RT-PCR Kit中的缓冲液也不容小觑，QIAGEN总是将秘密武器摆在最不起眼的缓冲液里。QuantiTect缓冲体系中特别均衡了铵离子和钾离子的比例以提高引物模板退火条件的严谨性，令非特异引物结合模板的比例大大减少，进一步减少非特异扩增，提高反应的专一性。同时也使得Taq酶受镁离子的影响降低到可以忽略的地步，也就不需要优化镁离子浓度啦。因为钾离子可以结合模板和引物上的磷酸骨架中和负电荷，提高模板引物结合力；铵根离子可以强化特异性结合的模板和引物，削弱那些非特异结合到模板上的引物之间的结合力。
除了试剂本身的性能，试剂盒的便利易用也是检测人员非常看重的。不单是方便操作人员，在遇上高致病性的病毒传播时，速度那可就是生命啊。QuantiTect Probe RT-PCR Kit也考虑到这一点，将试剂盒预装成Master Mix的形式，只需加入模板、引物和探针，即可使用。无需优化，同时也避免了可能发生的加样失误。
多重检测
如果你想一次检测多个目标，可以尝试一下QuantiTect multiplex PCR kit。同样无需优化，QIAGEN已经帮你做了这部分的工作，对试剂和步骤进行了预先的优化，你能轻松完成最多4个目标的定量分析。此试剂盒同样以Master Mix的形式提供，包含了HotStarTaq DNA聚合酶、ROX荧光染料、dNTP mix及独特的缓冲液。这里还是要重点提一下缓冲液，QIAGEN的缓冲液真是奥妙无穷啊。除了上文所述的钾离子和铵离子，这个还特别添加了MP因子，它能够增加模板上引物的局部浓度。与钾离子等其他阳离子共同作用，MP因子还能稳定特异结合的引物，让HotStarTaq DNA聚合酶进行更有效的引物延伸。
瑞士诺华生物医药研究中心（NIBR）的研究人员比较了ABI、Stratagene和Qiagen的三种定量Master Mix，希望能找到一种无需优化，性能接近单重分析的多重分析试剂。他们用三种Master Mix进行了40个TaqMan基因表达分析，并将结果与单重反应进行比较，发现只有Qiagen的QuantiTect multiplex PCR kit无需优化，就能在双重分析中产生可靠、重复性好的结果4。Wada等则利用QuantiTect multiplex PCR kit首次对全血和血浆中的EB病毒、巨细胞病毒和人疱疹病毒6同时进行定量，他们认为多重定量分析与单重分析同样灵敏和特异，并且能开发成更经济的诊断方法5。多重定量PCR的方法同样能应用于食品检测中。瑞士Canton Thurgau食品管理局的研究人员就在QuantiTect multiplex PCR kit的基础上，开发出肉类产品的检测方法，能同时定量样品中的牛肉、猪肉、鸡肉和火鸡肉成分。他们认为这种方法很准确，能让食品管理和生产控制实验室有效控制合成的肉类产品6。
如果你已经厌倦了定量PCR中的反反复复优化，那不妨来试试QIAGEN的定量试剂盒，肯定不会让你失望。
订购信息
名称 规格 货号
QuantiTect RT Kit for50×20 ul reactions 205311
QuantiFast SYBR Green PCR Kit for400×25 ul reactions 204054
参考文献：
1. Myers TA, Nickerson CA, Kaushal D, Otte CM, Höner zu Bentrup K, Rajee Ramamurthy, Nelman-Gonzalez M, Pierson DL, Philipp MT. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J Neurosci Methods 2008 174: 31-41.
2. Hoffmann B, Harder T, Starick E, Depner K, Werner O, Beer M. Rapid and Highly Sensitive Pathotyping of Avian Influenza A H5N1 Virus by Using Real-Time Reverse Transcription-PCR. J Clin Microbiol 2007 45(2) 600-3.
3. Hornberg A, Fernández SR, Vogl C, Vilcek S, Matt M, Fink M, Köfer J, Schöpf K. Genetic diversity of pestivirus isolates in cattle from Western Austria. Vet Microbiol. 2008. [Epub ahead of print]
4. Hein AE, Bodendorf U. Real-time PCR: duplexing without optimization. Anal Biochem. 2007 360(1):41-6.
5. Wada K, Kubota N, Ito Y, Yagasaki H, Kato K, Yoshikawa T, Ono Y, Ando H, Fujimoto Y, Kiuchi T, Kojima S, Nishiyama Y, Kimura H. Simultaneous Quantification of Epstein-Barr Virus, Cytomegalovirus, and Human Herpesvirus 6 DNA in Samples from Transplant Recipients by Multiplex Real-Time PCR Assay. J Clin Microbiol. 2007 45(5):1426-32.
6. Köppel R, Ruf J, Zimmerli F, Breitenmoser A. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef, pork, chicken and turkey. Eur Food Res Technol. 2008 227(4): 1199-1203.
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3. Hornberg A, Fernández SR, Vogl C, Vilcek S, Matt M, Fink M, Köfer J, Schöpf K. Genetic diversity of pestivirus isolates in cattle from Western Austria. Vet Microbiol. 2008. [Epub ahead of print]
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5. Wada K, Kubota N, Ito Y, Yagasaki H, Kato K, Yoshikawa T, Ono Y, Ando H, Fujimoto Y, Kiuchi T, Kojima S, Nishiyama Y, Kimura H. Simultaneous Quantification of Epstein-Barr Virus, Cytomegalovirus, and Human Herpesvirus 6 DNA in Samples from Transplant Recipients by Multiplex Real-Time PCR Assay. J Clin Microbiol. 2007 45(5):1426-32.
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